Этапы исследования первичной структуры белков и пептидов. Методы очистки, разделения и определения молекулярной массы белков и пептидов
НАВИГАЦИЯ ПО СТРАНИЦЕ
легко понять и запомнить
Этапы исследования первичной структуры белка:
Выделение белков из биологического материала и очистка их от низкомолекулярных примесей (диализ, гель-хроматография, высаливание, осаждение).
Выделение индивидуальных белков и разделение их по Молекулярной массе (хроматография, электрофорез, ультрацентрифугирование, изоэлектрофокусирование, аффинная хроматография).
Определение аминокислотного состава белка (ионообменная хроматография).
Определение аминокислотной последовательности белковой молекулы.
Разделение белков по молекулярной массе
Гель-хроматография. Хроматографическую колонку заполняют гранулами геля (сефадекс), который имеет поры определенной величины. В колонку вносят смесь белков. Белки, размер которых меньше, чем размер пор сефадекса, задерживаются в колонке, так как «застревают» в порах, а остальные свободно выходят из колонки. Размер белка зависит от его молекулярной массы.
Ультрацентрифугирование. Этот метод основан на различной скорости седиментации (осаждения) белковых молекул в растворах с различным градиентом плотности (сахарозный буфер или хлорид цезия). Чем больше молекулярная масса белка, тем быстрее и ниже он осядет.
В сахарозном буфере (градиент плотности формируют заранее).
В растворе CsCl (градиент плотности формируется в процессе центрифугирования).
Изоэлектрофокусирование. Используется пластина с амфолином — веществом, у которого заранее сформирован градиент pH. Проводят сначала электрофорез в горизонтальном направлении. Белки разделяются в зависимости от заряда (изоэлектрическая точка). Затем обрабатывают пластину раствором ДДС-Na и проводят электрофорез в вертикальном направлении. Белки разделяются в зависимости от молекулярной массы.
Гель-электрофорез. Типы геля: агаразный и полиакриламидный (ПААГ).
Белки продираются через гель, делятся по заряду и размеру (диаметру), проходят разные расстояния, но необязательно делятся по молекулярной массе.
Для разделения по молекулярной массе надо, чтобы белки имели одинаковую форму и двигались в одном направлении в соответствии с их молекулярными массами.
Белки нагревают и они разворачиваются в линейную форму. Затем добавляют восстановитель (он препятствует образованию дисульфидных связей) и ДДС-Na.
Денатурированный белок, связанный с ДДС-Na (неполярные части ДДС-Na связываются с неполярными группами белка внутри него, а снаружи, за счет сульфата – отрицательный заряд).
На выходе все белки имеют первичную структуру, отрицательно заряжены, движутся к аноду, а пройденный ими путь обратно пропорционален их молекулярной массе.
Диализ. Используют полупроницаемую мембрану: низкомолекулярные вещества (примеси) проходят через нее, а белки задерживаются.
Выделение индивидуальных белков
Аффинная хроматография. Метод основан на способности белков прочно связываться с различными молекулами нековалентными связями. Преимущество метода в том, что он позволяет выделить в чистом виде очень малые количества нужного белка. Используется для выделения и очистки ферментов, иммуноглобулинов, рецепторных белков. Молекулы веществ (лиганды), с которыми специфически связываются определенные белки, ковалентно соединяют с частицами инертного вещества. Смесь белков вносят в колонку и искомый белок прочно присоединяется к лиганду. Остальные белки свободно выходят из колонки. Задержанный белок затем можно вымыть из колонки с помощью буферного раствора, содержащего в свободном состоянии лиганд.
