Методы исследования аминокислотного состава и аминокислотной последовательности белков и пептидов. Сравнительный анализ гомологичных белков

Установление первичной структуры выделенного из смеси белка

Качественный и количественный анализ аминокислотного состава белка

1. Гидролиз:

   • кислотный (HCl);

   • щелочной [Ва(ОН)2];

   • ферментативный.

2. Ионообменная хроматография:

   • катионообменники (карбоксиметилцеллюлоза);

   • анионообменники (диэтиламиноэтилцеллюлоза).

При значениях рН буфера ниже ИЭТ, белок имеет положительный заряд и адсорбируется на катионообменнике и наоборот.

Определение N-концевой АК

• Метод Сенджера (присоединение к ФДНБ N-концевой аминокислоты).

• Метод Эдмана (ФИТЦ) – фенилизотиоцианат взаимодействует с N-концевой группой в слабощелачной среде. Далее происходит отщепление только N-концевой аминокислоты с сохранением остальной части полипептидной цепи.

• Взаимодействие N-концевой АК с дансилхлоридом с образованием флуоресцирующего соединения.

• Ферментативный метод (использование аминопептидаз — это ферменты которые избирательно отщепляют N-концевые АК, например, аланиновая аминопептидаза).

• Метод с использованием флуорескамина.

• Аминопептидазы.

Определение C-концевой АК

• Метод Акабори (гидразин разрушает все пептидные связи и реагирует со всеми АК, кроме концевой; концевую АК определяют после обработки смеси ФДНБ).

• Ферментативный метод (карбоксипептидазы А отщепляют ароматические С-концевые АК, карбоксипептидазы В — основные С-концевые АК).

Избирательный гидролиз

• Ферментативный метод (трипсин разрушает пептидные связи, образованные остатками основных кислот, а химотрипсин – ароматических аминокислот).

• Химический метод (цианоген бромид разрушает пептидные связи, образованные остатками мет).

Определение последовательности аминокислот в пептидах

• Секвенирование (секвенатор Эдмана-Бэга).

Сравнительный анализ гомологичных белков

(Метод Ингрэма, метод пептидных карт, метод «отпечатков пальцев»)

Метод сочетает в себе хроматографию (х/г) и электрофорез (э/ф) на бумаге продуктов неполного гидролиза сравниваемых белков.

Этапы:

1. Анализируемые белки расщепляются на пептиды.

2. Смесь пептидов каждого белка наносят на угол листа х/г бумаги.

3. Проводят э/ф в горизонтальном направлении.

4. Проводят распределение х/г в вертикальном направлении.

5. Полученные карты окрашивают и сравнивают.

6. Различающиеся пептидные пятна выделяют, анализируют их первичную структуру в секвенаторе.

Использование пептидных карт позволяет анализировать не всю молекулу белка, а только те фрагменты, которые различаются между собой.