Методы разделения белков, пептидов, аминокислот

Электрофорез

Данный метод основан на различной скорости миграции белков и пептидов в электрическом поле в зависимости от заряда. Носителями для электрофореза могут служить гели, ацетатцеллюлоза, агар.

Разделяемые молекулы движутся в геле в зависимости от размера: те из них, которые имеют большие размеры, будут задерживаться при прохождении через поры геля. Меньшие молекулы будут встречать меньшее сопротивление и, соответственно, двигаться быстрее.

В результате, после проведения электрофореза, большие молекулы будут находиться ближе к старту, чем меньшие.

Методом электрофореза можно разделить белки по молекулярной массе. Для этого используют электрофорез в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия (ДДS-Na). ДДС-Na является дифильным веществом и содержит заряженную группу и гидрофобную. Белки связываются с ДДС-Na своими гидрофобными радикалами и при этом денатурируют. Таким образом, белки выравниваются по форме и заряду. После этого подвижность белка при электрофорезе зависит только от его молекулярной массы.

Электрофорез белков крови

Ионообменная хроматография

Неподвижная фаза имеет заряженные группы: катионит «-» и анионит «+».

Ионообменные смолы – производные полистирола, целлюлозы, агаразы.

Этапы:

• Смолу заряжают.

• Через катионит пропускают р-р NaCl, и Na+ садится на гранулы смолы (это делают для того, чтобы весь катионит был повязан только ионами Na+, потому что в водной среде и смоле могут быть другие положительно заряженные катионы).

• Белок помещают в беферный растворм (рН=3), все белки заряжены «+».

• Пропускают смесь белка через колонку: -NH3-группы белка вытесняют Na+ и связываются со смолой.

• Возрастающими концентрациями NaCl белки, имеющие наименьший «+» заряд (много асп и глу), выходят из колонки первыми, за ними – белки, где много нейтральных аминокислот; белки, связанные со смолой наиболее прочно (много арг, лиз и гис), выходят последними.

Адсорбционная хроматография

Основана на различиях в сорбируемости разделяемых белков адсорбентом (Al2O3, силикагель), и последующем вымывании этих белков соответствующими элементами.

Белки связываются с полярной поверхностью адсорбента полярными группами, поэтому легче вымыть более неполярные белки. Для этого используются неполярные элюенты (хлороформ, гексан, диэтиловый эфир).

Распределительная хроматография

С неподвижным носителем (крахмал, гель, бумага) химически связана стационарная (полярная) фаза.

Подвижная фаза – неполярная, которая служит растворителем.

Скорость движения молекул зависит от возможности растворяться в неполярном растворителе.

Вестерн-блот анализ (иммуноэлектрофорез)

В основе метода – принципы комплементарности и гибридизации.

Этапы:

• Выделение белков из биологического материала.

• Разделение белков по молекулярной массе методом электрофореза в ПААГ с ДДС-Na.

• Перенос белков на ацетатцеллюлозу + груз сверху, получаем реплики белка на пластине (блоты пока не видны).

• Обработка пластины раствором неспецифического белка, чтобы «забить» оставшиеся поры.

• Обработка раствором первичных антител (это антитела к искомому белку), они связываются с искомым белком, если он есть.

• Промывка (для удаления не связавшихся антител).

• Обработка раствором меченых вторичных антител (молекулярный зонд).

• Промывка для удаления несвязавшихся вторичных антител.

• Проявка: авторадиография (или обработка пластины раствором субстрата).

Применение: диагностика ВИЧ, гепатита, выделение индивидуальных белков, в судебно-медицинской экспертизе.