... > Биологическая химия > Методы разделения белков,...

Методы разделения белков, пептидов, аминокислот

НАВИГАЦИЯ ПО СТРАНИЦЕ

Электрофорез Ионообменная хроматография Адсорбционная хроматография Распределительная хроматография Вестерн-блот анализ
ПОЛНЫЙ ОТВЕТ
БЕЗ ВОДЫ
Без воды — краткий вариант ответа,
легко понять и запомнить

Электрофорез

Данный метод основан на различной скорости миграции белков и пептидов в электрическом поле в зависимости от заряда. Носителями для электрофореза могут служить гели, ацетатцеллюлоза, агар.

Разделяемые молекулы движутся в геле в зависимости от размера: те из них, которые имеют большие размеры, будут задерживаться при прохождении через поры геля. Меньшие молекулы будут встречать меньшее сопротивление и, соответственно, двигаться быстрее.

В результате, после проведения электрофореза, большие молекулы будут находиться ближе к старту, чем меньшие.

Методом электрофореза можно разделить белки по молекулярной массе. Для этого используют электрофорез в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия (ДДS-Na). ДДС-Na является дифильным веществом и содержит заряженную группу и гидрофобную. Белки связываются с ДДС-Na своими гидрофобными радикалами и при этом денатурируют. Таким образом, белки выравниваются по форме и заряду. После этого подвижность белка при электрофорезе зависит только от его молекулярной массы.

Электрофорез белков крови

Электрофорез белков крови

Ионообменная хроматография

Неподвижная фаза имеет заряженные группы: катионит «-» и анионит «+».

Ионообменные смолы – производные полистирола, целлюлозы, агаразы.

Этапы:

  • Смолу заряжают.

  • Через катионит пропускают р-р NaCl, и Na+ садится на гранулы смолы (это делают для того, чтобы весь катионит был повязан только ионами Na+, потому что в водной среде и смоле могут быть другие положительно заряженные катионы).

  • Белок помещают в беферный растворм (рН=3), все белки заряжены «+».

  • Пропускают смесь белка через колонку: -NH3-группы белка вытесняют Na+ и связываются со смолой.

  • Возрастающими концентрациями NaCl белки, имеющие наименьший «+» заряд (много асп и глу), выходят из колонки первыми, за ними – белки, где много нейтральных аминокислот; белки, связанные со смолой наиболее прочно (много арг, лиз и гис), выходят последними.

Адсорбционная хроматография

Основана на различиях в сорбируемости разделяемых белков адсорбентом (Al2O3, силикагель), и последующем вымывании этих белков соответствующими элементами.

Белки связываются с полярной поверхностью адсорбента полярными группами, поэтому легче вымыть более неполярные белки. Для этого используются неполярные элюенты (хлороформ, гексан, диэтиловый эфир).

Распределительная хроматография

С неподвижным носителем (крахмал, гель, бумага) химически связана стационарная (полярная) фаза.

Подвижная фаза – неполярная, которая служит растворителем.

Скорость движения молекул зависит от возможности растворяться в неполярном растворителе.

Вестерн-блот анализ (иммуноэлектрофорез)

В основе метода – принципы комплементарности и гибридизации.

Этапы:

  • Выделение белков из биологического материала.

  • Разделение белков по молекулярной массе методом электрофореза в ПААГ с ДДС-Na.

  • Перенос белков на ацетатцеллюлозу + груз сверху, получаем реплики белка на пластине (блоты пока не видны).

  • Обработка пластины раствором неспецифического белка, чтобы «забить» оставшиеся поры.

  • Обработка раствором первичных антител (это антитела к искомому белку), они связываются с искомым белком, если он есть.

  • Промывка (для удаления не связавшихся антител).

  • Обработка раствором меченых вторичных антител (молекулярный зонд).

  • Промывка для удаления несвязавшихся вторичных антител.

  • Проявка: авторадиография (или обработка пластины раствором субстрата).

Применение: диагностика ВИЧ, гепатита, выделение индивидуальных белков, в судебно-медицинской экспертизе.

homedigitalschool.ru

Полезные ссылки:

zaka-zaka

Покупай игры выгодно

РЕКЛАМА, ООО «ГЕЙБСТОР» ИНН: 7842136365

zaochnik

Срочная помощь в написании всех видов работ

РЕКЛАМА, ООО «ЗАОЧНИК.КОМ.» ИНН: 7710949967

skyeng

Лучшие из курсов английского в Skyeng

РЕКЛАМА, ОАНО ДПО «СКАЕНГ» ИНН: 9709022748