Мононуклеотиды, их строение и роль в клетке. Метод анализа первичной структуры ДНК (Сэнджера)

Мононуклеотид состоит из молекулы азотистого основания, пентозы и остатка фосфорной кислоты.

• Пентозы мононуклеотидов – рибоза и дезоксирибоза, поэтому различают рибонуклеотиды и дезоксирибонуклеотиды.

• Азотисные основания: пиримидиновые (тимин, цитазин, урацил) и пуриновые (аденин и гуанин).

Биологическая роль:

1. Универсальный источник энергии в клетке (АТФ, ГТФ).

2. Являются активаторами и переносчиками мономеров в клетке (например, УДФ-глюкоза, ЦДФ-холин).

3. Являются аллостерическими регуляторами активности ферментов (АТФ/АДФ).

4. Входят в состав коферментов (НАД+, НАДФ+, ФАД, КоА-SH).

5. Циклические мононуклеотиды (цАМФ, цГМФ) являются вторичными посредниками действия гормонов и других сигналов на клетку.

6. Мономеры в составе нуклеиновых кислот.

Роль циклических нуклеотидов:

• образуется с помощью еще одной фосфодиэфирной связи – цАМФ, цГМФ;

• образуются благодаря ферменту нуклеотидциклазе.

Эти нуклеотиды выполняют роль внутриклеточных посредников в действии гормонов на клетку.

Первичная структура нуклеиновых кислот – это последовательность мононуклеиновых кислот, соединенных 3'-5'-фосфодиэсеразной связью.

Строение ДНК

Вторичная структура ДНК – двойная спираль. Принципы построения: принципы комплиментарности и антипараллельности.

Третичная структура формируется только в связи с белком.

В ДНК входят 4 типа АО: А, Т, Г, Ц; сахар дезоксирибоза. Связь между нуклеотидами образуется с участием 3'-ОН- группы одного нуклеотида и 5'-остатком фосфорной кислоты другого (3'–5'-фосфодиэфирная связь). В результате молекула полинуклеотида приобретает направленность — у нее есть 3'-конец и 5'-конец.

Локализация в клетке: ядро, немного в цитозоле.

Функции ДНК:

• хранение, воспроизводство и передача по наследству генетического материала,

• экспрессия генов.

Строение РНК

Отличия от ДНК:

• по локализации (цитоплазма);

• по функциям (обеспечивает биосинтез белка);

• по размерам, по строению (содержит У вместо Т, сахар — рибоза).

РНК бывает нескольких типов — иРНК, рРНК, тРНК, гяРНК (гетерогенная ядерная РНК), мяРНК (малая ядерная РНК).

Вторичная структура — всегда одна цепь (у тРНК — «лист клевера»).

Третичная структура — у тРНК формируется самостоятельно и похожа на объемную букву L; у рРНК и иРНК образуется в связи с белками (рРНК + белок = рибосома, иРНК + белок = информосома).

Метод Сэнжера

Метод основан на моделировании ДНК-полимеразной реакции, где исследуемая молекула ДНК (с неизвестной последовательностью нуклеотидов) используется в качестве матрицы.

В модельную систему входят:

• одноцепочечный фрагмент исследуемой ДНК (матрица);

• небольшой затравочный олигонуклеотид (праймер);

• субстраты для синтеза дочерней цепи (дНТФ четырех типов: дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ);

• фермент ДНК-полимераза.

Порядок выполнения:

1. ДНК-полимераза ведет синтез дочерних цепей комплементарно матрице.

2. Для остановки синтеза протокол секвенирования, предложенный Ф. Сэнджером, предполагает использование 2', 3'-дидезоксинуклеотидов (ддНТФ). После включения такого нуклеотида дальнейшее наращивание цепи невозможно из-за отсутствия свободной ОН-группы в 3'-положении пентозы. Реакция проводится одновременно в четырех отдельных пробирках, в каждой из которых содержатся все 4 дНТФ и один тип ддНТФ.

3. Во все пробы добавляют радиоактивно меченый «нормальный» дНТФ, либо используют меченый праймер, чтобы можно было по окончании синтеза обнаружить продукты реакции.

4. Разделяют полученные фрагменты методом электрофореза в геле, при этом небольшие синтезированные молекулы проходят дальше, а крупные остаются ближе к линии старта (вверху).

5. После ауторадиографии (проявки геля) «читают» полученную электрофореграмму снизу вверх и определяют, в какой последовательности ДНК-полимераза включала нуклеотиды в растущую цепь. Последовательность нуклеотидов в исследуемой молекуле ДНК легко установить (она комплементарна той, которую синтезировала ДНК-полимераза).

Протокол секвенирования по Сэнджеру