Полимеразная цепная реакция. Клонирование. Основные этапы и применение в медицинской практике

Этапы:

1. денатурация ДНК (Т до 90°С);

2. добавление специфического праймера и охлаждение ДНК (Т до 55°С) (отжиг);

3. добавление нуклеотидов (субстратов синтеза) и ДНК-полимеразы (фермента синтеза);

4. повторение цикла.

Позволяет за короткое время получить множество копий ДНК (порядка 20 млн за 0,5 ч).

Применение ПЦР:

• диагностика вирусных и бактериальных инфекций (ВИЧ, гепатит, хламидиоз, туберкулез, менингита);

• генетическая диагностика заболеваний;

• судебная медицина;

• изучение генома человека.

Действуют в области палиндромов ДНК – мест, где последовательность нуклеотидов одной цепи идентична последовательности нуклеотидов другой цепи, прочитанной в обратном порядке. В молекулярной биологии рестриктазы используют для создания генетических векторов (внедрение гена в плазмиду и т.п.).

В качестве векторов применяется:

• плазмида – небольшая кольцевидная молекула ДНК бактерий, реплицируемая независимо от нуклеоида;

• бактериофаг лямбда;

• хромосомы дрожжей;

• космидные векторы – гибрид фага лямбда и плазмиды.

Этапы клонирования:

1. получение генетического материала (разрезание рестриктазами вектора и внедряемого гена с образованием палиндромов);

2. включение гена в векторную молекулу с помощью лигаз и создание рекомбинантной ДНК;

3. введение рекомбинантной ДНК в клетку хозяина;

4. отбор трансформированных клеток на селективных средах.

Применение:

• получение разнообразных вакцин и иммунологических диагностикумов;

• синтез ряда БАВ: СТГ, инсулин, эритропоэтин, интерфероны, факторы свертывания крови;

• получение ферментов в промышленности;

• получение относительно недорогого пищевого белка для животных и т.д.