Методы исследования фиксированных тканей. Этапы изготовления препарата

Исследование мертвых (фиксированных) клеток и тканей. В исследовательской и учебной работе фиксированные клетки и ткани используются значительно чаще, чем живые. При этом объектами изучения являются постоянные препараты:

• тотальный препарат — мелкий организм, эмбрион, маленький орган или его часть, кусочек ткани, пленка эпителия и другие, которые укладывают на предметное стекло целиком и заключают в среду под покровное стекло;

• тонкий срез органа толщиной 5–10 мкм или гистологический препарат (наиболее часто используется в гистологических исследованиях);

• мазок делается на стекле из биологического материала, имеющего жидкую или полужидкую консистенцию, например из образца крови, взвеси клеток в жидкой культуральной среде, капли красного костного мозга и т.п.;

• отпечаток — поверхность свежего среза органа, например печени, прижимают к предметному стеклу и затем анализируют морфологию клеток, прилипших к нему;

• пленочный препарат изготавливают из тонкослойных биологических объектов, например эпителиального пласта, прослойки соединительной ткани, мозговой оболочки и т.п.

Основные этапы изготовления гистологического препарата

Взятие материала. Материал должен быть свежим, не подвергшимся аутолизу. Обычно рекомендуют брать кусочек материала размером 1×1×0,5 см и в любом случае объемом не более 1-2 см3. Его вырезают с учетом цели исследования и немедленно фиксируют.

Фиксация необходима для максимального сохранения структуры клеток и тканей, инактивации ферментов лизосом, остановки обменных процессов, уничтожения микроорганизмов.

Различают химические (с помощью реактивов) и физические (замораживание, нагревание, высушивание, микроволновая обработка) способы фиксации.

В гистологической практике чаще используются химические способы или замораживание. Примеры простых химических фиксаторов — 10 % формалин, 70–96 % спирт, сложных фиксаторов — смеси различных веществ (например, спирт, хлороформ, уксусная кислота). Продолжительность фиксации (от нескольких минут до нескольких недель) зависит от размеров объекта, используемого фиксатора и цели исследования. Для удаления фиксатора проводится промывка образца в проточной воде длительностью от нескольких часов до одних суток.

Обезвоживанием подготавливают ткани к пропитыванию парафином. Для этого материал помещают в спирты восходящей крепости (50, 60, 70, 80, 90, 96, 100 %), выдерживая его в каждом растворе по 12-24 ч, а затем — в смесь спирта с хлороформом.

Уплотнение придает исследуемому образцу достаточную плотность, чтобы обеспечить получение срезов толщиной до 5-10 мкм. Пропитывание проводят сначала в растворе парафина в хлороформе, затем в расплавленном парафине. Пропитанный кусочек органа быстро переносят в небольшую емкость и немедленно заливают расплавленным парафином.

Приготовление срезов. После охлаждения парафиновый блок режут с помощью микротома на срезы. Парафиновые срезы наклеивают на стекло и после депарафинирования окрашивают гистологическими красителями.

Окрашивание позволяет выявить малоконтрастные структуры в клетках, тканях и органах.

Для обзорной окраски общего назначения часто используют красители с различными химическими свойствами, например, сочетание слабой кислоты — эозина и слабого основания — гематоксилина. Эозин окрашивает цитоплазму в розовый цвет (оксифильно) ввиду амфотерности ее белков. Гематоксилин окрашивает ядро в сине-фиолетовый цвет (базофильно) из-за высокой концентрации нуклеиновых кислот. Гистологический срез, окрашенный этим методом, способен сохранять свой цвет и контраст несколько десятков лет.

Заключение срезов в бальзам. После обезвоживания и просветления на срез наносят каплю бальзама и накрывают покровным стеклом. В бальзаме между стеклами срез остается прозрачным и пригодным для исследования многие годы.

Для срочного исследования биопсийный материал, полученный во время операции, быстро замораживают и режут в криостате (замораживающем микротоме), окрашивают, заключают в желатин и просматривают под микроскопом, экономя время на фиксации, обезвоживании и уплотнении, но качество морфологической картины в этом случае уступает парафиновым срезам.

Методы исследования фиксированных клеток и тканей

• световая микроскопия. Наиболее широко распространенным методом исследования в гистологии является световая микроскопия — совокупность методов изучения мелких объектов с помощью световых (оптических) микроскопов. Эти методы зависят от типа объектива микроскопа, вида микрообъекта, способа подготовки его для наблюдения, а также от характера его освещения при наблюдении;

• электронная микроскопия. Просвечивающая (трансмиссивная) электронная микроскопия. Характерной особенностью этого метода является использование пучка электронов, получивших ускорение в вакууме за счет высокого напряжения, для просвечивания тонкого среза ткани. Фокусирующими линзами служат магнитные поля, экраном — слой вещества, чувствительного к воздействию электронов. Диапазон увеличения от 2-3 до 100-300 тысяч раз, что позволяет детально изучать структуру клеточного ядра, ядрышка, хромосом, органелл, а также наблюдать крупные полимерные молекулы, например ДНК;

• сканирующая электронная микроскопия. От просвечивающей электронной микроскопии отличается тем, что на поверхность объекта исследования в вакууме напыляется тонкий слой металла, а затем производится облучение объекта пучком электронов. Изображение формируется электронами, отраженными от металлизированной поверхности и напоминает трехмерную картину реального макромира;

• другие виды микроскопии. Помимо различных вариантов световой (поляризационная, интерференционная, фазоконтрастная, темнопольная, люминесцентная, конфокальная лазерная микроскопия) и электронной микроскопии для исследования гистологических объектов используются ультрафиолетовая, рентгеновская, ультразвуковая, атомная силовая и другие виды микроскопии. Каждый из этих методов имеет свои преимущества и недостатки и применяется для решения узкоспециальных исследовательских задач;

• цито- и гистохимия. Большая группа цитохимических и гистохимических методов основана на принципе проведения химической реакции непосредственно на гистологическом срезе и получения продуктов реакции в виде цветных осадков. Последующий анализ распределения и количества этих продуктов позволяет сделать вывод о физиологических и биохимических процессах, протекающих в клетках и тканях. Этими методами можно выявлять локализацию в тканях белков и отдельных аминокислот, гликогена, гликозаминогликанов, липидов, ДНК и РНК, разнообразных ферментов, витаминов, пигментов (гемоглобина, меланина, липофусцина, билирубина), неорганических элементов — Fe, Ca, K, Zn и др. Иммуноцито- и иммуногистохимия. Подобно предыдущей группе методов, применяется на гистологических срезах. Метод основан на специфическом взаимодействии активных центров меченых красителями иммуноглобулинов и антигенов белков, а также других веществ, воспринимаемых иммунной системой как антигены. Специфичность метода очень высока — он позволяет различить два белка, отличающиеся друг от друга на одну аминокислоту. Широко применяется для выявления и определения локализации разнообразных белков в клетках и тканях.