Иммуноферментный анализ. ИФА тестсистемы III и IV поколения. Иммуноблоттинг. Практическое применение ИФА, иммуноблоттинга

Иммуноферментный анализ

Иммуноферментный анализ (ИФА) – это наиболее распространенный современный метод, используемый для диагностики вирусных, бактериальных и протозойных инфекций. В частности, это основной метод диагностики вирусных гепатитов, ВИЧ-инфекции, вируса Эпштейна-Барр, герпетических инфекций, ИППП. ИФА также используется для определения множества низкомолекулярных соединений и макромолекул (маркеры аутоиммунных заболеваний, гормоны).

ИФА имеет несколько видов, однако все они предполагают использование антигенов или антител, меченных ферментом (например, пероксидазой хрена). После их добавления к исследуемому материалу и отмывки в среду вносят субстрат, расщепляемый этим ферментом, и хромоген, окрашивающий среду при расщеплении субстрата.

В случае образования иммунного комплекса меченный реагент не удаляется при отмывке, расщепляет субстрат и приводит к окрашиванию среды в определенный цвет. Интенсивность окрашивания измеряется колориметрически.

Гомогенный ИФА проводится в жидкой фазе, имеет меньшую чувствительность, пригоден только для определения низкомолекулярных веществ и получил небольшое распространение (наборы для определения токсических и наркотических субстанций).

Гетерогенный ИФА проводится на твердой фазе, когда известный компонент реакции (антиген или антитело) адсорбированы на твердом носителе – в лунках коммерчески производимых микропланшетов. Каждая инкубация в гетерогенном ИФА заканчивается отмывкой – удалением свободных (несвязавшихся) реагентов.

Гетерогенный ИФА имеет множество вариантов, основными из которых являются:

1. прямой ИФА (поиск АГ):

   • на поверхности лунок реагенты изначально отсутствуют;

   • материал вносят в лунки и инкубируют с целью закрепления в них антигенов;

   • в лунки вносят меченые антитела к искомым антигенам;

   • схема: (пустая лунка) → АГ + АТ*

2. непрямой ИФА (поиск АТ):

   • на поверхности лунок сорбированы антигены;

   • материал вносят в лунки, после чего антитела связываются с антигенами;

   • в лунки вносят меченые антитела к антителам (к иммуноглобулину человека);

   • схема: АГ + АТ + АТ*

3. сэндвич ИФА (поиск АГ):

   • на поверхности лунок сорбированы антитела;

   • в лунки последовательно вносят и инкубируют материал, диагностические антитела (идентичные сорбированным) и меченые антитела к иммуноглобулину человека;

   • схема: АТ + АГ + АТ + АТ*

4. конкурентный ИФА:

   • используется в нескольких модификациях, однако общий принцип заключается в конкуренции между мечеными АГ или АТ с имеющимися в материале

   • оцениваются конкурентные реакции обратным образом: чем интенсивнее изменение цвета, тем меньше искомых АГ или АТ имеется в материале;

   • поиск АТ можно производить следующим образом: к сорбированному АГ одновременно добавляются меченые АТ и сыворотка с искомыми АТ, после чего лунка отмывается; чем больше в сыворотке искомых АТ, тем меньше меченых АТ останется после отмывки и тем менее выраженной будет реакция;

   • поиск АГ можно производить следующим образом: к сорбированному АГ одновременно добавляются меченые АТ и материал с искомыми АГ, после чего лунка отмывается; чем больше в материале искомых АГ, тем меньше меченых АТ останется после отмывки и тем менее выраженной будет реакция;

     конкурентный поиск АГ также можно проводить с использованием меченых АГ.

Понятие «поколений» тест-системы для ИФА применимо только для систем, используемых для диагностики ВИЧ. Использовавшиеся ранее тест-системы I и II поколения содержали лизированный или обработанный ультразвуком вирус. Системы III и IV поколения содержат полученные рекомбинантным способом белки, что резко снизило число ложноположительных результатов и повысило чувствительность.

Особенностью систем III поколения стала возможность отдельно определять IgM и IgG, а системы IV поколения, в дополнение к этому, способны определять антиген p24. «Период окна», когда вирус не всегда возможно выявить лабораторно, для систем I/II поколения составляет шесть месяцев, для систем III/IV поколения – три месяца.

Иммуноблоттинг

Иммуноблоттинг (вестерн-блот) – это метод, в основе которого лежит разделение антигенов элетрофорезом и перенос их отпечатка (англ. blot – пятно) на носитель. Далее методика аналогична непрямому ИФА. Метод включает следующие этапы:

1. в геле методом электрофореза разделяют по площади известные антигены вируса;

2. на гель накладывают нитроцеллюлозную пленку, перенося тем самым на нее АГ; (как правило, в лабораториях используют готовые коммерческие пленки)

3. пленку инкубируют с сывороткой пациента, предположительно содержащей АТ;

4. после отмывки добавляют меченные ферментом АТ к Ig человека, субстрат и хромоген, что при наличии комплексов АГ-АТ приводит к появлению цветных полос.

При отрицательном результате окрашенные полосы на пленке не появляются. Важным достоинством метода является возможность определения антител сразу к нескольким антигенам возбудителя. В настоящее время метод широко используется как подтверждающий тест на ВИЧ-инфекцию и, в меньшей степени, на гепатит С.