Контроль иммунного ответа Т-лимфоцитами (Th3, T-регуляторы, CD4+CD25+). Методы определения количества и функциональной активности Т-лимфоцитов

Контроль иммунного ответа Т-лимфоцитами (Th3, T-регуляторы, CD4+CD25+)

Т-регуляторы (Тh3), помимо CD4, несут еще и CD25, поэтому их обозначают CD4+CD25+. Они активируются под влиянием различных факторов, а при активации выделяют трансформирующий ростовой фактор бета (ТРФ-β) и ИЛ-10. Эти цитокины способствуют супрессии иммунного ответа, уменьшая активность как Т-хелперов, так и Т-киллеров.

Методы определения количества и функциональной активности Т-лимфоцитов

Для определения количества Т-лимфоцитов используют следующие методы:

1. лимфоцитотоксический метод – к суспензии клеток добавляют антитела к CD3 и комплемент, что приводит к формированию иммунных комплексов с Т-лимфоцитами и их повреждению активированным комплементом; поврежденные клетки окрашивают трипановым синим и подсчитывают;

2. метод розеткообразования с эритроцитами барана;

3. ИФА или РИФ с использованием антител к CD3, CD4 или CD8.

Для определения функциональной активности Т-лимфоцитов используют следующие методы:

1. реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ, оценка пролиферативной активности в ответ на стимулы) – культивирование клеток в присутствии митогенных (стимулирующих размножение) или антигенных стимуляторов с добавлением меченого изотопом тимидина; после нескольких дней сравнивают радиоактивность суммарной ДНК в присутствии стимулятора и без либо подсчитывают число бластных клеток;

2. метод предельных разведений – в множество лунок закладываются микрокультуры лимфоцитов в убывающих разведениях, которые обеспечиваются всеми факторами роста в избытке, а также стимулируются одним антигеном (то есть пролиферация будет наблюдаться в тех лунках, где есть хотя бы один Т-лимфоцит, специфический к данному антигену); оценивая количество «положительных» лунок, с помощью специальных графиков рассчитывают процент специфических клеток в исходной популяции;

3. оценка продукции цитокинов – определение в крови пациента либо при культивировании лимфоцитов in vitro; применяют биологические методы (оценка эффекта стимуляции исследуемым материалом клеточных культур тимоцитов), серологические (ИФА) и молекулярно-генетические (выявление в клетках мРНК, используемой для синтеза цитокинов, например методом ОТ-ПЦР);

4. определение экспрессии маркеров активации (CD25, CD69, CD71) методом проточной цитфлоуриметрии;

5. определение цитотоксичности CD8+ лимфоцитов – клетки-мишени метятся радиоактивным хромом, после чего инкубируются с цитотоксическими лимфоцитами; радиоактивность смеси после инкубации пропорциональна количеству лизированных клеток, то есть по сути активности цитотоксических лимфоцитов.