Культивирование вирусов. Культуры клеток. Индикация и идентификация вирусов в культуре клеток. Типы ЦПД. Вирусные включения
НАВИГАЦИЯ ПО СТРАНИЦЕ
Культивирование вирусов. Клеточные культуры
Вирусы могут культивироваться в культурах клеток, куриных эмбрионах и лабораторных животных. Эти методы являются длительными, трудоемкими и затратными, но в то же время считаются «золотым стандартом» диагностики.
Культуры клеток, используемые для культивирования вирусов, разделяют на:
первичные:
получают из ткани путем механического измельчения и обработки протеолитическими ферментами;
наиболее распространены культуры клеток почек обезьян, почек эмбриона человека, амниона человека;
срок жизни органичен (2-3 недели);
полуперевиваемые:
срок жизни увеличен, способы выдерживать 50-100 пассажей;
наиболее распространены культуры фибробластов эмбриона человека;
перевиваемые:
обладают потенциальным бессмертием;
большинство происходят из опухолевых клеток;
наиболее распространены культуры HeLa (карцинома шейки матки), Hep-2 (карцинома гортани), RH (почка человека).
Для культивирования клеток необходимы питательные среды, которые по своему назначению делятся на ростовые и поддерживающие. Ростовые среды обеспечивают активное размножение клеток для формирования монослоя, а поддерживающие – переживание клеток в уже сформированном монослое при размножении в клетке вирусов.
Для заражения используют культуры в пробирках с хорошо развитым монослоем клеток. Перед заражением клеток питательную среду удаляют и в каждую пробирку вносят взвесь материала, предварительно обработанного антибиотиками для уничтожения бактерий и грибов.
После 30-60 мин. контакта вируса с клетками удаляют избыток материала, вносят в пробирку поддерживающую среду и оставляют в термостате до выявления признаков размножения вируса.
Индикация и идентификация вирусов в культуре. ЦПД. Вирусные включения
Индикация вирусов – это процесс установления наличия их в культуре без уточнения видовой принадлежности.
Для индикации используются следующие методы:
определение цитопатического действия (ЦПД), то есть характерного нарушения морфологии клеток, обнаруживаемого при микроскопии культур:
гигантские многоядерные клетки – симпласты (парамиксовирусы);
скопления набухших круглых клеток (аденовирусы);
крупнозернистая дегенерация (герпесвирусы);
дегенерация клеток с вакуолизацией (ретровирусы, флавивирусы);
отсутствие ЦПД (также может быть диагностическим признаком);
определение бляшкообразования:
бляшки – это участки монослоя, на которых клетки разрушены вирусом;
выглядят как зоны просветления;
могут подсчитываться для определения цитопатогенности вируса в бляшкообразующих единицах (БОЕ).
положительная реакция гемадсорбции;
положительная реакция интерференции (при отсутствии ЦПД);
цветная реакция:
в среду вносят индикатор pH, который при нормальной жизнедеятельности клеток изменяет окраску из-за накопления в среде различных метаболитов;
при заражении вирусом клеточный метаболизм резко снижается и окраска индикатора не изменяется;
образование в клетках вирусных включений:
представляют собой вирусные «фабрики» или скопления вирусных частиц;
цитоплазматические: тельца Негри (бешенство), тельца Гварниера и Пашена (натуральная оспа);
внутриядерные: тельца Каудри (простой герпес и ветряная оспа), Липшютца (ветряная оспа), «совиные глаза» (цитомегаловирусная инфекция).
Идентификация вирусов – это процесс надежного установления их видовой принадлежности. Она проводится при помощи серологических методов (РТГА, РТГАдс, РН, РСК, РНГА, ИФА, РИФ, РИА) и молекулярно-генетических методов (ПЦР, молекулярная гибридизация).