Культивирование вирусов. Культуры клеток. Индикация и идентификация вирусов в культуре клеток. Типы ЦПД. Вирусные включения

Культивирование вирусов. Клеточные культуры

Вирусы могут культивироваться в культурах клеток, куриных эмбрионах и лабораторных животных. Эти методы являются длительными, трудоемкими и затратными, но в то же время считаются «золотым стандартом» диагностики. 

Культуры клеток, используемые для культивирования вирусов, разделяют на:

1. первичные:

   • получают из ткани путем механического измельчения и обработки протеолитическими ферментами;

   • наиболее распространены культуры клеток почек обезьян, почек эмбриона человека, амниона человека;

   • срок жизни органичен (2-3 недели);

2. полуперевиваемые:

   • срок жизни увеличен, способы выдерживать 50-100 пассажей;

   • наиболее распространены культуры фибробластов эмбриона человека;

3. перевиваемые:

   • обладают потенциальным бессмертием;

   • большинство происходят из опухолевых клеток;

   • наиболее распространены культуры HeLa (карцинома шейки матки), Hep-2 (карцинома гортани), RH (почка человека).

Для культивирования клеток необходимы питательные среды, которые по своему назначению делятся на ростовые и поддерживающие. Ростовые среды обеспечивают активное размножение клеток для формирования монослоя, а поддерживающие – переживание клеток в уже сформированном монослое при размножении в клетке вирусов.

Для заражения используют культуры в пробирках с хорошо развитым монослоем клеток. Перед заражением клеток питательную среду удаляют и в каждую пробирку вносят взвесь материала, предварительно обработанного антибиотиками для уничтожения бактерий и грибов. 

После 30-60 мин. контакта вируса с клетками удаляют избыток материала, вносят в пробирку поддерживающую среду и оставляют в термостате до выявления признаков размножения вируса.

Индикация и идентификация вирусов в культуре. ЦПД. Вирусные включения

Для индикации используются следующие методы:

• определение цитопатического действия (ЦПД), то есть характерного нарушения морфологии клеток, обнаруживаемого при микроскопии культур:

  • гигантские многоядерные клетки – симпласты (парамиксовирусы);

  • скопления набухших круглых клеток (аденовирусы);

  • крупнозернистая дегенерация (герпесвирусы);

  • дегенерация клеток с вакуолизацией (ретровирусы, флавивирусы);

  • отсутствие ЦПД (также может быть диагностическим признаком);

• определение бляшкообразования:

  • бляшки – это участки монослоя, на которых клетки разрушены вирусом;

  • выглядят как зоны просветления;

  • могут подсчитываться для определения цитопатогенности вируса в бляшкообразующих единицах (БОЕ).

  • положительная реакция гемадсорбции;

  • положительная реакция интерференции (при отсутствии ЦПД);

• цветная реакция:

  • в среду вносят индикатор pH, который при нормальной жизнедеятельности клеток изменяет окраску из-за накопления в среде различных метаболитов;

  • при заражении вирусом клеточный метаболизм резко снижается и окраска индикатора не изменяется;

• образование в клетках вирусных включений:

  • представляют собой вирусные «фабрики» или скопления вирусных частиц;

  • цитоплазматические: тельца Негри (бешенство), тельца Гварниера и Пашена (натуральная оспа);

  • внутриядерные: тельца Каудри (простой герпес и ветряная оспа), Липшютца (ветряная оспа), «совиные глаза» (цитомегаловирусная инфекция).