Методы идентификации выделенной чистой культуры бактерий. Идентификация микроорганизмов без выделения чистой культуры

Идентификация по морфологическим, культуральным и биохимическим критериям

Методы идентификации чистой культуры опираются на критерии вида микроорганизмов.

Наименее надежными из них являются морфологические и культуральные. Изучения размеров, формы, взаимного расположения, тинкториальных свойств и характера роста на плотных и в жидких средах иногда может быть достаточно для выдачи предварительного заключения.

Достаточно надежно идентифицировать микроорганизм вплоть до вида (иногда подвида) можно при помощи метода биохимической идентификации. Его сущность заключается в определении ферментативной активности бактерий, а для анаэробов также определении профиля летучих жирных кислот.

Для определения вида в подавляющем большинстве случаев необходимо проведение многих биохимических тестов (нескольких десятков). Принцип биохимической идентификации (или, по крайней мере, сужения круга поиска) также используется в дифференциально-диагностических средах.

Применяются также одноразовые тест-системы для биохимической идентификации. Они представляют собой пластиковые планшеты с лунками, заполненными субстратами с индикатором рН. Тест-системы позволяют изучать сразу до 64 биохимических признаков.

Приводим наиболее важные из определяемых ферментов:

• карбогидразы (гидролиз углеводов) – среды Эндо, Левина, Плоскирева с лактозой и анилиновыми красителями; + окрашенные колонии;

• желатиназа (протеаза) – посев уколом в столбик; + разжижение желатина;

• триптофаназа (гидролиз триптофана с образованием индола) – МПБ с триптофаном и щавелевой кислотой (индикатор индола); + розовое окрашивание;

• десульфураза (удаление серы из цистеина и метионина) – среды с серосодержащими АК и солями железа; + почернение среды из-за образования сульфидов металлов;

• уреаза (гидролиз мочевины) – среда с мочевиной и феноловым красным; + покраснение среды;

• лецитиназа (расщепление лецитинов) – желточный агар; + появление вокруг колоний опалесцирующих зон (венчиков помутнения);

• оксидаза (ОВР) – индикаторная бумага; + фиолетовое окрашивание;

• каталаза (ОВР) – внесение капли H2O2; + появление пузырьков газа;

• гемолизины (вызывают гемолиз эритроцитов) – посев на кровяной агар; β-гемолиз (полный) – зоны просветления вокруг колоний; α-гемолиз (неполный) – зоны зеленого цвета вокруг колоний; γ-гемолиз (отсутствие гемолиза) – без изменений;

• плазмокоагулаза (коагуляция плазмы) – внесение культуры в цитратную плазму крови кролика; + образование желеобразного сгустка.

Идентификация по серологическим, биологическим и генетическим критериям

С целью установления видовой принадлежности бактерий часто изучают их антигенное строение, то есть проводят серологическую идентификацию – идентификацию по антигенным свойствам. Каждый микроорганизм имеет в своем составе разные антигенные субстанции. В частности, представители семейства энтеробактерий могут содержать соматический О-антиген, жгутиковый Н-антиген и капсульный К-антиген. Их можно определить с помощью специфических агллютинирующих антисывороток. Этот метод относят к одному из главных методов установления вида (и серовара) выделенной культуры.

Чаще всего используется ориентировочная реакция агглютинации на стекле. С этой целью на предметное стекло наносят разные диагностические антисыворотки, а затем в каждую каплю вносят небольшое количество чистой культуры. За несколько минут наблюдают за феноменом агглютинации. Образование агглютината (хлопьев) свидетельствует о гомологичности антигенов возбудителя и антител диагностической сыворотки, что позволяет определить вид инфекционного агента. При наличии позитивной ориентировочной реакции агглютинации ее ставят в развернутом варианте.

Используются и другие реакции: РНГА, РСК, РП, РИФ, ИФА. Методика их проведения подробно описывается в Иммунологии.

Иногда идентификацию бактерий проводят, заражая лабораторных животных чистой культурой и наблюдая за теми изменениями, которые вызывают возбудители в организме (туберкулез, ботулизм, столбняк, сальмонеллез). Такой метод называют биологической идентификацией.

Надежными и высокоспецифичными, но сложными и дорогостоящими являются молекулярно-генетические методы идентификации, в особенности основанные на выявлении характерных последовательностей ДНК (ПЦР, ДНК-гибридизация, секвенирование).

Серологический (РИФ для хламидий и микоплазм; ИФА для вируса гепатита В и ВИЧ) и молекулярно-генетический (туберкулез, хламидии, вирусы гепатитов) методы идентификации могут применяться без выделения чистой культуры, то есть непосредственно в биологическом материале. Это имеет первостепенное значение для экспресс-диагностики, а также для идентификации некультивируемых или плохокультивируемых микроорганизмов.