Принципы молекулярно-генетического анализа. Методы, основанные на изучении фрагментов ДНК. Методы, основанные на гибридизации нуклеиновых кислот

Принципы молекулярно-генетического анализа

Материал для молекулярно-генетического анализа зависит от симптомов, патогенеза возможного заболевания: 

• клинический биоматериал от больного (кровь, смывы, соскобы, слюна, гной, мокрота, спинномозговая жидкость, желудочный сок, отделяемое из уретры, моча, испражнения, биоптат тканей и органов);

• пробы из объектов внешней среды (пищевые продукты, вода, почва);

• чистые культуры микроорганизмов.

Этапы исследований:

1. Взятие материала, маркировка, транспортировка, подготовка проб к исследованию, хранение. 

2. Экстракция ДНК/РНК. 

3. Проведение молекулярно-генетических исследований.

4. Анализ и интерпретация результатов, выдача заключения. 

Методы, основанные на изучении фрагментов ДНК:

Плазмидное типирование:

• из бактерий выделяют плазмидную ДНК;

• обрабатывают рестриктазами, что приводит к фрагментированию ДНК;

• электрофорез в агарозном геле.

Метод позволяет оценить количество плазмид, их размер, а также характер образуемых рестрикционных фрагментов. Плазмидный анализ широко используется в эпидемиологических исследованиях, особенно при расследовании вспышек заболеваний, вызванных такими микроорганизмами, как Staphylococcus spp., P. aeruginosa, представителями семейства Enterobactereaceae. Однако многие клинические штаммы способны терять плазмиды, особенно в процессе многочисленных пересевов в лаборатории. 

Рестрикционно-эндонуклеазный анализ (REA):

• бактериальную хромосому нарезают рестриктазами на множество фрагментов;

• проводят электрофорез в пульсирующем электрическом поле, в результате которого фрагменты ДНК выстраиваются в зависимости от размера в шеренгу, образуя уникальный видоспецифический профиль. 

По сходству рестрикционных профилей изучаемого и известных видов микроорганизмов можно идентифицировать и типировать микроорганизмы. Обычно для рестрикции используют макрорестриктазы — ферменты, распознающие участки, состоящие из 6 или более нуклеотидов. Такие участки распознавания присутствуют в геноме в небольшом количестве, поэтому в результате действия макрорестриктаз образуется до 30 достаточно крупных фрагментов. С помощью данного метода анализируется около 90 % бактериальной хромосомы. С помощью компьютеризированной системы сканирования гелей могут быть созданы базы данных ретрикционных профилей для многих микроорганизмов. 

Методы, основанные на гибридизации нуклеиновых кислот

Метод молекулярной гибридизации позволяет выявить степень сходства различных ДНК. Применяется при идентификации микробов для определения их точного таксономического положения.

Варианты проведения:

1. В растворе;

2. В тканевых срезах (in situ);

3. На микрочипах (эррей-гибридизация);

4. На мембранах.

Этапы реакции гибридизации на мембранах:

1. Выделение ДНК. Методы аналогичны методам выделения ДНК для проведения ПЦР.

2. Получение мелких фрагментов изучаемой ДНК (не более 5000–10 000 п. о.): либо рестрикция крупной молекулы ДНК, либо ПЦР с образованием небольших ампликонов, либо обработку ультразвуком.

3. Нанесение ДНК на мембрану

   • дот-блоты или слот-блоты. Перед нанесением ДНК денатурируют, превращают в одноцепочечные молекулы. Затем небольшие фрагменты изучаемой ДНК наносят на мембрану в виде точек (дот-блоты) либо полосок (слот-блоты);

   • аузерн-блоты. Небольшие фрагменты изучаемой ДНК предварительно разделяют электрофорезом в полиакриламидном геле. ДНК переносят из геля на поверхность мембран.

4. Перенесенную на мембрану ДНК фиксируют при 80 ºС или УФ-светом.

5. Гибридизация проводится в несколько этапов:

   • обработка предгибридизационным буфером мембраны с ДНК, что увеличивает связывающую способность мембраны;

   • приготовление гибридизационного раствора, содержащего буфер и меченый зонд;

   • программирование гибридизационной камеры и проведение гибридизации при 65 ºС.

6. Анализ результатов. Если зонд комплементарен одноцепочечному участку ДНК изучаемого микроорганизма, происходит связывание зонда и исследуемой ДНК. Некомплементарные несвязавшиеся зонды удаляют промыванием. В месте связывания зонда выявляют флюоресценцию или изменение цвета.