Виды микроскопов. Принципы фазово-контрастной, люминесцентной, электронной микроскопии

Фазово-контрастная микроскопия

Глаз человека плохо различает бесцветные прозрачные объекты, так как интенсивность света, который через них проходит, не меняется. В то же время фаза колебаний прошедшего света меняется, но глаз эти изменения уловить не в состоянии. Основной принцип фазово-контрастной микроскопии – перевести неуловимые глазом фазовые изменения в уловимые изменения интенсивности света.

При микроскопии свет источника освещения проходит через конденсор и кольцевую диафрагму, которые тонко фокусируют его на образце. Часть света рассеивается частицами образца, при этом фаза колебаний света смещается на -90° – это рассеянный свет. Другая часть света попадает в объектив неизменённой – это фоновый свет. В случае с прозрачным образцом рассеянный свет получается слабым, поэтому изображение слабо отличается от фона. Такой маленький контраст человеческий глаз уловить не в состоянии.

В фазово-контрастном микроскопе имеется фазовое кольцо, при прохождении через которое фоновый свет также смещается на -90° и его фаза становится такой же, как у рассеянного света. В результате изображение в точках, где на фоновый свет накладывается рассеянный свет, становится заметно ярче. Это происходит благодаря тому, что фазовые изменения (см. векторы в (a)) были преобразованы в изменения интенсивности (см. векторы в (b)).

Дополнительно эту разницу усиливают при помощи кольцевого нейтрального светофильтра. Через его кольцо преимущественно проходит и ослабляется фоновый свет, что делает разницу между изображением и фоном еще более сильной. В итоге прозрачные части изучаемого объекта выглядят более яркими, чем их окружение.

Все описанное верно для негативного фазового контраста. Используется еще и позитивный фазовый контраст, при котором фоновый свет смещают не на -90°, а на +90°. В результате вектор рассеянного света становится антипараллельным и вычитается из вектора фонового света. В остальном принцип метода такой же. При его использовании прозрачные части изучаемого объекта выглядят более темными, чем их окружение.

Люминесцентная микроскопия

Люминесцирующие вещества поглощают свет, а затем испускают его, но уже с большей длиной волны: ультрафиолет «преобразовывается» в синий, синий – в зеленый и т.д.

При люминесцентной микроскопии источником света служит ртутная лампа, испускающая много света в сине-фиолетовом и ультрафиолетовом диапазонах. Следом за источником устанавливается первый светофильтр, пропускающий только ультрафиолет или коротковолновой свет (фиолетовый и синий).

Допустим, что первый светофильтр пропускает только фиолетовый свет. Тогда от образца, содержащего люминесцирующие вещества, будет исходить рассеянный фиолетовый свет и вызванный люминесценцией синий свет. Чтобы рассеянный свет не мешал наблюдать люминесценцию, в окуляре размещают второй светофильтр, отсекающий фиолетовый свет. В итоге до наблюдателя вообще не доходит свет от ртутной лампы, а только лишь вызванное им свечение синего цвета из-за люминесценции.

Только очень малая часть объектов исследования в микробиологии обладают собственной (первичной) люминесценцией. Большинство необходимо окрашивать флюорохромами – люминесцирующими красителями. Используют также реакцию иммунофлюоресценции, после проведения которой с помощью люминесцентной микроскопии можно быстро идентифицировать микроорганизм.

Электронная микроскопия

В просвечивающих электронных микроскопах установлена электронная пушка, которая направляет пучок электронов на заранее подготовленный препарат. Изучаемый объект «прокрашивают» солями тяжелых металлов, после чего из него делают ультратонкие срезы. Проходя через них, часть электронов задерживается и не доходит до экрана. Хорошо отражающие электроны части клеток на экране выглядят светлыми, плохо отражающие – темными.

В сканирующих электронных микроскопах пучок электронов фокусируется в тонком зонде, который движется по поверхности образца. Изображение формируют те электроны, что отражаются от поверхности образца. Если же напылить на образец электронно плотное вещество, то можно получить точную реплику поверхности изучаемого объекта.

1 – темнопольная микроскопия (трепонемы); 2 и 3 – поле зрения в световом и фазово-контрастном микроскопе (живые клетки); 4 – люминесцентная микроскопия (риккетсии); 5 – сканирующая электронная микроскопия (кишечная палочка)